紫杉醇生物合成面臨“卡脖子”難題
“4萬塊錢一瓶的藥吃了三年，房子吃沒了，家人被吃垮了。”電影《我不是藥神》中一段話讓不少人潸然淚下，吃不起的“天價(jià)救命藥”背后是歐美制藥企業(yè)對(duì)于專利技術(shù)的壟斷。如何讓更多人能夠吃上“更便宜、更有效”的救命藥？自主研發(fā)是關(guān)鍵。
為解決“明星抗癌藥”紫杉醇生物合成的“卡脖子”難題，打破國(guó)外技術(shù)壟斷，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心）聯(lián)合北京大學(xué)、清華大學(xué)等國(guó)內(nèi)外六家單位開展技術(shù)攻關(guān)，在國(guó)際上率先實(shí)現(xiàn)了紫杉醇的生物合成，有望解決“明星抗癌藥”紫杉醇供應(yīng)不足的問題。
北京時(shí)間2024年1月26日凌晨3時(shí)，國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)（Science）》在線發(fā)表了基因組所（省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心）閆建斌研究員與北京大學(xué)雷曉光教授等合作完成的最新研究成果：“Characterization and heterologous reconstitution of Taxus biosynthetic enzymes leading to baccatin III（巴卡亭III生物合成酶的鑒定與異源重構(gòu)）”，研究發(fā)現(xiàn)了紫杉醇生物合成途徑中的兩個(gè)缺失的關(guān)鍵酶“T9αH”“TOT”，闡明了關(guān)鍵結(jié)構(gòu)分子—紫杉烷氧雜環(huán)丁烷的形成機(jī)制，打通了紫杉醇生物合成途徑。該研究成果標(biāo)志著我國(guó)在紫杉醇合成生物學(xué)理論和技術(shù)上站在了世界領(lǐng)先地位。
“明星抗癌藥”紫杉醇是什么？
在自然界中，存在一類天然產(chǎn)物藥物，被廣泛應(yīng)用于癌癥治療、預(yù)防心血管疾病等，紫杉醇就是其中一種。作為一種高效、低毒、廣譜的天然抗癌藥物，紫杉醇因其藥效顯著和用途廣泛，被譽(yù)為“明星抗癌藥”，廣泛應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、食管癌、胃癌和大腸癌等多種癌癥的臨床治療。
然而，天然紫杉醇來源稀缺且單一，僅能從珍稀瀕危裸子植物紅豆杉中提取，但紅豆杉生長(zhǎng)速度緩慢，極為稀少，素有“植物大熊貓”之稱。不僅如此，紫杉醇在紅豆杉植物中的含量極低，數(shù)千棵紅豆杉中僅能提取出1公斤左右的紫杉醇，而一個(gè)治療1個(gè)卵巢癌患者至少需要幾十克紫杉醇。
如何不依賴紅豆杉，實(shí)現(xiàn)紫杉醇的生物合成？這是擺在全世界科學(xué)家面前的一個(gè)難題。
自上世紀(jì)80年代起，科學(xué)家便開始尋找一種可以替代天然提取紫杉醇的合成方法，1990年，美國(guó)率先研發(fā)出一條紫杉醇半合成路線，并迅速投入商業(yè)化生產(chǎn)，在此后的30余年內(nèi)，全球上百個(gè)科研團(tuán)隊(duì)相繼投入到紫杉醇的生物全合成研究中，但均未能實(shí)現(xiàn)突破。經(jīng)過多年的探索，基因組所（省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心）研究團(tuán)隊(duì)領(lǐng)銜解決了這一世界級(jí)難題，找到了一條無需消耗天然紅豆杉資源、不依賴土壤種植的綠色可持續(xù)生產(chǎn)方法。
破解生物合成難題
紫杉醇的生物合成途徑高度復(fù)雜，涉及羥化、酰化、環(huán)氧化等多個(gè)生化反應(yīng)和19個(gè)合成關(guān)鍵酶。
想要實(shí)現(xiàn)紫杉醇在異源系統(tǒng)中的生物合成，需要突破三個(gè)難點(diǎn)。一是找到紫杉醇關(guān)鍵生物合成酶；二是解析關(guān)鍵合成酶的催化機(jī)制；三是通過酶的組合實(shí)現(xiàn)異源重建生物合成路線。
自紫杉醇發(fā)現(xiàn)以來的半個(gè)世紀(jì)里，絕大多數(shù)紫杉醇合成相關(guān)基因均由歐美研究團(tuán)隊(duì)主導(dǎo)完成。最先進(jìn)的紫杉醇提取技術(shù)、核心的紅豆杉細(xì)胞生產(chǎn)技術(shù)和基因工程技術(shù)等，依然牢牢掌控在歐美制藥公司的手中，如美國(guó)的百時(shí)美施貴寶制藥公司，法國(guó)的賽諾菲公司，德國(guó)Phyton公司等。
2021年，閆建斌團(tuán)隊(duì)領(lǐng)銜繪制國(guó)際首張染色體級(jí)別的南方紅豆杉高質(zhì)量參考基因組圖譜，揭示了紅豆杉合成抗癌藥物紫杉醇的遺傳基礎(chǔ)，為紫杉醇生物合成途徑的解析提供了基因組學(xué)藍(lán)圖和關(guān)鍵候選基因。相關(guān)研究成果以封面文章形式發(fā)表在《自然植物（Nature Plants）》上。
在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì)58個(gè)紫杉醇生物合成關(guān)鍵候選基因進(jìn)行篩選，成功發(fā)現(xiàn)了能夠催化氧雜環(huán)丁烷環(huán)合成的細(xì)胞色素P450酶，命名為TOT1（紫杉烷氧雜環(huán)丁烷合酶，Taxane Oxetanase 1）。在紅豆杉細(xì)胞中敲低該基因的表達(dá)量，能夠顯著降低巴卡亭III和紫杉醇的生物合成。
由于難以分離C9位未被氧化的中間體，在過去三十年中科學(xué)家始終未能鑒定催化紫杉烷C9氧化的酶。因此，研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)造性地構(gòu)建了紫杉素的生物合成植物底盤，利用該底盤和生物信息學(xué)分析，從17個(gè)候選基因中篩選出了負(fù)責(zé)紫杉烷 C9 位氧化酶的T9αH1（Taxane 9α hydroxylase 1）。該基因位于紅豆杉的9號(hào)染色體上，介于T2αH和T7βH兩個(gè)已知的紫杉醇合成基因之間。
傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，紫杉醇氧雜環(huán)丁烷的形成涉及兩步過程：首先，4(20)-烯-5α-乙酸酯結(jié)構(gòu)被環(huán)氧化，生成 4(20)β-環(huán)氧-5α-乙酰氧基三元環(huán)中間體（稱為環(huán)氧化物），然后通過重排反應(yīng)從環(huán)氧化物生成氧雜環(huán)丁烷。也就是說，環(huán)氧化物的形成是生成氧雜環(huán)丁烷的先決條件。然而，本研究發(fā)現(xiàn)TOT1并不能催化三元環(huán)中間體向四元環(huán)的轉(zhuǎn)變，而是將雙鍵結(jié)構(gòu)同時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)槿h(huán)和四元環(huán)結(jié)構(gòu)，從而證明了環(huán)氧化物不是氧雜環(huán)丁烷形成的必要中間體。
通過密度泛函理論（DFT）計(jì)算與酶的底物選擇性檢測(cè)，研究者們進(jìn)一步揭示了環(huán)氧化物和氧雜環(huán)丁烷都可以通過 TOT1 酶中的羰基離子中間體（Int1）產(chǎn)生，但氧雜環(huán)丁烷環(huán)產(chǎn)物的生成在能量和動(dòng)力學(xué)上都比環(huán)氧化物更有利，解釋了氧雜環(huán)丁烷為優(yōu)勢(shì)產(chǎn)物的分子機(jī)制。這一研究結(jié)果，顛覆了30年來人類對(duì)于該結(jié)構(gòu)生成機(jī)制的傳統(tǒng)認(rèn)知，填補(bǔ)了僅在植物界中存在的環(huán)擴(kuò)張反應(yīng)生成含氧四元環(huán)結(jié)構(gòu)的分子機(jī)制的缺失。
在解決了關(guān)鍵酶缺失的問題后，研究人員利用人工異源合成途徑構(gòu)建策略，將新鑒定得到的酶與已知合成酶進(jìn)行組合，通過多次嘗試，成功在植物底盤中生成了巴卡亭III。該合成路線僅需9個(gè)關(guān)鍵生物合成酶（TOT1、T9αH1、TXS、T5αH、T13αH、T2αH、T7βH、TAT、TBT），進(jìn)一步研究顯示，這些核心基因受到植物激素茉莉素的共表達(dá)調(diào)控，具有相似的誘導(dǎo)表達(dá)模式和顯著的表達(dá)相關(guān)性，說明這些基因在細(xì)胞中受到密切的協(xié)同調(diào)控。結(jié)合亞細(xì)胞定位分析等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該研究繪制出了巴卡亭III的完整生物合成過程：
1、 起始底物GGPP在葉綠體中被TXS酶催化形成紫杉二烯。
2、 紫杉二烯通過質(zhì)體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的接觸點(diǎn)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)之后，受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錨定的六個(gè)氧化酶（T2αH、T5αH、T7βH、T9αH、T13αH 和 TOT）與兩個(gè)細(xì)胞質(zhì)定位的酰基轉(zhuǎn)移酶（TAT和TBT）的協(xié)同催化，生成巴卡亭III。
該研究不僅對(duì)指導(dǎo)紅豆杉遺傳育種和種質(zhì)資源的高效利用具有重要意義，更能夠?yàn)槲覈?guó)的紫杉醇合成底盤改造提供數(shù)據(jù)和專利保障，為我國(guó)的紫杉醇綠色制造產(chǎn)業(yè)化鋪平道路。
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心）為第一單位。基因組所閆建斌研究員和北京大學(xué)雷曉光教授為論文的共同通訊作者，基因組所碩士畢業(yè)生蔣彬、北京大學(xué)高磊特聘副研究員和博士研究生王海軍、基因組所博士研究生孫亞平為該論文的共同第一作者。
該研究得到了中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部、國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院、北京分子科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合研究中心、廣東省、北京市、深圳市及大鵬新區(qū)的資助。項(xiàng)目資助的第一標(biāo)注為合成生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃。
專家點(diǎn)評(píng)
中國(guó)科學(xué)院院士趙國(guó)屏
紫杉醇是人類迄今為止開發(fā)的最有效的抗癌天然產(chǎn)物藥物，其異常復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了生物合成途徑解析的空前難度。在過去數(shù)十年的時(shí)間里，歐美國(guó)家已解析了合成途徑涉及的多個(gè)細(xì)胞色素 P450 單加氧酶、酰基轉(zhuǎn)移酶和變位酶等，但仍因部分關(guān)鍵功能基因未被鑒定，導(dǎo)致合成通路不完整。該工作綜合利用基因組學(xué)、代謝組學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、合成生物學(xué)的技術(shù)手段，成功解析了紫杉醇合成途徑中尚未被發(fā)現(xiàn)的若干關(guān)鍵催化酶，并利用植物底盤實(shí)現(xiàn)了合成路線的人工重構(gòu)。閆建斌研究員領(lǐng)銜完成的這一研究成果結(jié)束了闡明紫杉醇生物合成途徑的漫長(zhǎng)研究歷史，標(biāo)志著在天然化合物生物合成途徑解析以及人工底盤通路重構(gòu)方面的教科書式的突破；也生動(dòng)代表著我國(guó)一批中青年科學(xué)家，在合成生物學(xué)領(lǐng)域探索奮斗近二十年所達(dá)到的里程碑式新高度。相信只要在“會(huì)聚研究”方向上繼續(xù)辛勤耕耘、協(xié)同攻關(guān)，我們一定能取得對(duì)生命本質(zhì)的新認(rèn)識(shí)，開拓合成生物制造的新前景。
中國(guó)科學(xué)院院士陳曉亞
紫杉醇是世界著名的植物抗癌天然產(chǎn)物藥物，臨床上用于治療多種癌癥，由于在植物中含量很低，十分珍貴。自1971 年紫杉醇結(jié)構(gòu)鑒定以來，其生物合成途徑一直沒有打通。閆建斌課題組及合作者們成功鑒定了紫杉醇生物合成途徑中缺失的關(guān)鍵酶，揭示了紫杉醇氧雜環(huán)丁烷成環(huán)的酶學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了紫杉醇前體巴卡亭III的最短異源生物合成路線，實(shí)現(xiàn)了紫杉醇生物合成途徑的重構(gòu)。該研究是植物代謝生物學(xué)與合成生物學(xué)領(lǐng)域的重大突破，為利用合成生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)紫杉醇的綠色可持續(xù)生產(chǎn)鋪平了道路。
中國(guó)科學(xué)院院士鄧子新
癌癥是危害我國(guó)人民健康與生命的大敵，防治癌癥已上升為國(guó)家戰(zhàn)略。世界銷量第一的抗腫瘤天然產(chǎn)物藥物是紫杉醇，但其生產(chǎn)仍然依賴有限的紅豆杉天然資源。開發(fā)綠色環(huán)保的紫杉醇生物合成策略對(duì)于我國(guó)的癌癥防治戰(zhàn)略具有重大意義。半個(gè)世紀(jì)以來，紫杉醇生物合成領(lǐng)域的前沿突破主要由歐美國(guó)家的科學(xué)家主導(dǎo)完成，閆建斌課題組及合作者們繼率先繪制完成國(guó)際首張南方紅豆杉基因組圖譜之后，進(jìn)一步破解了長(zhǎng)期以來紫杉醇生物合成途徑的“卡脖子”難題，鑒定了最具挑戰(zhàn)的未知合成酶，實(shí)現(xiàn)了紫杉醇關(guān)鍵生產(chǎn)前體合成路線的人工重構(gòu)。該研究實(shí)現(xiàn)了紫杉醇合成生物學(xué)領(lǐng)域的引領(lǐng)性原創(chuàng)成果重大突破，為實(shí)現(xiàn)我國(guó)紫杉醇生物智造的自立自強(qiáng)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，具有里程碑意義。
美國(guó)兩院院士 Jens Nielsen（瑞典查爾姆斯理工大學(xué)終身教授，美國(guó)科學(xué)院、美國(guó)工程院、中國(guó)工程院等八個(gè)國(guó)家級(jí)科學(xué)院或工程院的院士或外籍院士，諾貝爾獎(jiǎng)評(píng)審委員會(huì)委員、國(guó)際代謝工程協(xié)會(huì)創(chuàng)會(huì)主席）
原文：Natural products produced by plants serve an important role in medicine, food and agriculture. The biosynthesis of these molecules is often involving many different chemical steps and the enzymes catalyzing these steps have in many cases not been identified. This hinders our ability to produce these valuable chemicals is sufficient amounts for the benefit of people and society. In this study of Professor Jianbin Yan they identified an important enzyme involved in biosynthesis of baccatin, an important anti-cancer drug. This finding is a major breakthrough in our understanding of the biosynthesis of complex natural products, and it will enable our abilities to produce other valuable natural products at scale and hereby develop new and valuable medicines.
翻譯：植物產(chǎn)生的天然產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中扮演著重要的角色。這些分子的生物合成通常涉及許多不同的化學(xué)步驟，而且催化這些步驟的酶在大多情況下尚未被鑒定。這阻礙了我們生產(chǎn)足夠數(shù)量的寶貴化學(xué)物質(zhì)來造福人類和社會(huì)的能力。在閆建斌教授領(lǐng)銜的這項(xiàng)研究中，他們發(fā)現(xiàn)了一種參與重要抗癌藥物巴卡亭的生物合成的重要酶。這一發(fā)現(xiàn)是我們對(duì)復(fù)雜天然產(chǎn)物生物合成的理解的重大突破，它將使我們有能力大規(guī)模生產(chǎn)其他有價(jià)值的天然產(chǎn)物，從而開發(fā)出有價(jià)值的新藥。
美國(guó)兩院院士 Gregory Stephanopoulos（美國(guó)麻省理工學(xué)院教授，美國(guó)科學(xué)院院士，美國(guó)國(guó)家工程院院士）
原文：It was first isolated in the bark of the Pacific Yew, and in the first years, it took several old trees to isolate enough material for the treatment of just a few cancer patients. This situation has since been corrected and the drug is now available in large quantities through various advances. Yet the elucidation of the metabolic pathway responsible for the synthesis of paclitaxel has been an unsolved problem for many years. This background makes the recent publication by the group of Professor Yan in Science a very important accomplishment indeed. The group succeeded in identifying the enzymes and genes that are responsible for the last two steps of key reactions in the synthesis of baccatin III, the key precursor in the taxol biosynthetic pathway. Doctor Yan and his group identified the taxol oxetanase that catalyzes the oxetane ring formation and another enzyme that is responsible for the taxane oxidation at the C9 position, thus they filled the gaps in the paclitaxel synthesis pathway. Besides constituting a very important contribution to basic science, this development is also significant for two additional reasons. First for opening the way for the more effective and cheaper synthesis of the taxol drug, but also for the new ability to synthesize many derivatives in search of more potent anti-cancer drugs.
翻譯：它最初是從太平洋紫杉的樹皮中分離出來的，早些年，需要幾棵老樹才能分離出足夠的原料來治療幾個(gè)癌癥患者。后來，經(jīng)過各種研究進(jìn)展，這種情況得到了改善，現(xiàn)在可以大量獲得這種藥物。然而，多年來，紫杉醇合成代謝途徑的闡明一直是一個(gè)懸而未決的問題。在這一背景下，閆教授課題組領(lǐng)銜的最近在《科學(xué)》雜志上發(fā)表的論文確實(shí)是一項(xiàng)非常重要的成就。該研究小組成功地鑒定了負(fù)責(zé)合成巴卡亭III這一紫杉醇生物合成途徑中關(guān)鍵前體的最后兩個(gè)關(guān)鍵反應(yīng)步驟的酶和基因。閆博士及其研究小組發(fā)現(xiàn)了催化氧雜環(huán)丁烷環(huán)形成的紫杉醇氧雜環(huán)丁烷環(huán)合酶和另一種負(fù)責(zé)紫杉烷 C9 位氧化的酶，從而填補(bǔ)了紫杉醇合成途徑的空白。除了對(duì)基礎(chǔ)科學(xué)的重要貢獻(xiàn)之外，這一進(jìn)展還有兩個(gè)重要影響。首先，它更為有效、更廉價(jià)的合成紫杉醇藥物開辟了道路，同時(shí)也為合成多種衍生物以尋找更有效的抗癌藥物提供了新的機(jī)遇。
